Der Experimentator Zellbiologie by Sabine Schmitz & Christine Desel

Autor:Sabine Schmitz & Christine Desel
Die sprache: deu
Format: epub
ISBN: 9783662561119
Herausgeber: Springer Berlin Heidelberg

4.12 Fluoreszierende Reporterproteine

Die wichtigsten Reporterproteine für die Fluoreszenzmikroskopie sind (1.) das – vom Wild-typ-GFP abgeleitete – EGFP (engl. green fluorescent protein) und (2.) seine zahlreichen Varianten (z. B: ECFP, EYFP, Cerulean, Venus) [42]. Die fluoreszierenden Proteine der Reportergene (fluorescent proteins, FP) wurden in den letzten Jahren hinsichtlich ihrer Stabilität und Fluoreszenzeigenschaften, ihres Faltungsverhaltens, ihrer Reifungsgeschwindigkeit und ihres Oligomerisierungsgrads weiterentwickelt und verbessert [2, 22, 58]. Im natürlichen Zustand liegen viele FPs als Oligomere vor. Da Aggregation und Komplexbildung der Fusionsproteine vermieden werden sollen, werden monomere Varianten in zellbiologischen Analysen bevorzugt.

Für die Auswahl der geeigneten Fluoreszenzproteine für die eigenen Analysen sind zunächst die spektralen Eigenschaften (Exzitations- und Emissionsspektren) entscheidend (s. Abschn. 4.4). Die Signale sollten von der Autofluoreszenz im zu untersuchenden Gewebe unterscheidbar und mit den verfügbaren Geräten detektierbar sein (s. Abschn. 4.3). Bei Mehrfachmarkierungen müssen die Spektren der Fluorochrome ausreichend gut trennbar sein (s. Abschn. 4.11). Signale im kurzwelligen Bereich sind häufig besser differenzierbar und auch für das menschliche Auge gut erkennbar. Die Detektion von Fluoreszenzproteinen im langwelligen Bereich ist allerdings schonender und weniger phototoxisch, insbesondere für lebende Zellen. Für die intravitale Mikroskopie werden Fluoreszenzproteine mit Spektren im langwelligen Bereich bevorzugt (z. B. dtTomato, mCherry). Darüber hinaus durchdringt langwelliges Licht Gewebe tiefer und wird weniger gestreut [30, 75].

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